SYSTEMY MARKERÓW MOLEKULARNYCH I ICH ZASTOSOWANIE W HODOWLI,
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Tom 54 2005
Numer 2–3 (267–268)
Strony 227–239
J
OANNA
S
ZTUBA
-S
OLIŃSKA
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin Oddział Bydgoszcz
Al. Powstańców Wielkopolskich 10, 85-090 Bydgoszcz
e-mail: j.sztuba@ihar.bydgoszcz.pl
SYSTEMY MARKERÓW MOLEKULARNYCH I ICH ZASTOSOWANIE W HODOWLI
ROŚLIN
WPROWADZENIE
Badanie polimorfizmu DNA stało się moż-
liwe dzięki opracowaniu systemów wyko-
rzystujących markery molekularne. Systemy
markerów molekularnych stały się głównym
narzędziem analiz genetycznych przełamują-
cym bariery, z którymi borykały się konwen-
cjonalne metody hodowli. Stosowanie metod
molekularnych umożliwiło analizę przekazu
genów między spokrewnionymi odmiana-
mi, stwierdzenie introgresji między odległy-
mi ewolucyjnie osobnikami, a także badanie
cech poligenicznych.
Niniejsze opracowanie obejmuje cha-
rakterystykę systemów markerów moleku-
larnych oraz możliwości ich zastosowania
w analizach genetycznych i w hodowli roślin
uprawnych.
DEFINICJA MARKERA
Marker to wyznacznik, dowolna, gene-
tycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub
też dowolna różnica genetyczna wykorzysty-
wana dla ujawnienia polimorfizmu osobni-
czego. Pod pojęciem polimorfizmu rozumie
się całokształt różnic występujących między
poszczególnymi gatunkami, odmianami, osob-
nikami, a także komórkami organizmu, które
potencjalnie mogą być ujawniane za pomocą
odpowiednio dobranego systemu markero-
wego. System markerowy o wysokiej uży-
teczności powinien nie tylko ujawniać szero-
ki zakres zmienności analizowanej cechy, ale
także nie powinien ulegać wpływowi czynni-
ków środowiskowych. Użyteczność systemu
analiz uzależniona jest również od wysokiej
powtarzalności wyników, łatwości detekcji
oraz możliwości szczegółowego poznania
mechanizmów warunkujących występowanie
danej właściwości organizmu.
Początkowo do analizy zmienności or-
ganizmów stosowano markery morfologicz-
ne, czyli cechy fenotypowe, których ekspre-
sja umożliwia ocenę sposobu dziedziczenia.
Następnie dołączyły do nich markery cyto-
logiczne bazujące na obserwacji aberracji
chromosomowych w genomie danego orga-
nizmu, umożliwiające m.in. ocenę poziomu
ploidalności oraz analizę transferu genów.
Analiza polimorfizmu struktury molekularnej
polipeptydów mogących pośrednio odzwier-
ciedlać zmienność materiału genetycznego,
przyczyniła się do rozwoju markerów białek
strukturalnych oraz białek enzymatycznych.
Obecnie, najczęściej stosowanymi technika-
mi analizy zróżnicowania organizmów są sys-
temy markerów molekularnych ujawniające
zmienność sekwencji nukleotydowej DNA.
228
J
OANNA
S
ZTUBA
-S
OLIŃSKA
SYSTEMY MARKERÓW MOLEKULARNYCH
Współcześnie znane są liczne techniki
umożliwiające identyfikację polimorfizmu or-
ganizacji i struktury materiału genetycznego,
zarówno w obrębie sekwencji kodujących,
jak i niekodujących. Przełomowymi odkry-
ciami dla ich rozwoju było zaproponowa-
nie sekwencji DNA i modelu jego replikacji
(W
ATSON
i C
RICK
1953), następnie wyizo-
lowanie po raz pierwszy polimerazy DNA
(K
ORNBERG
i współaut. 1955), wyizolowanie
i scharakteryzowanie pierwszej sekwencyj-
nie specyficznej endonukleazy restrykcyjnej
(S
MITH
i W
ILCOX
1968) oraz opracowanie
metody sekwencjonowania DNA (M
AXAM
i G
ILBERT
1977). Systemy markerów moleku-
larnych umożliwiają analizę zróżnicowania
organizmów niezależnie od ich fazy rozwo-
jowej i wpływu czynników środowiskowych.
Ponadto, metody molekularne gwarantują
wysoką powtarzalność wyników i łatwość
aplikacji, co decyduje o ich wysokim stopniu
użyteczności. Poszczególne techniki analizy
zmienności materiału genetycznego różnią
się między sobą, co wynika z ich specyfiki,
typu i poziomu polimorfizmu, który określa-
ją. Ze względu na sposób identyfikacji zmien-
ności genetycznej systemy markerów mole-
kularnych można podzielić na kilka kategorii,
których charakterystykę przedstawiono w ni-
niejszej pracy.
CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW MARKERÓW MOLEKULARNYCH
Przebieg analizy polimorfizmu za pomo-
cą omawianych poniżej kategorii systemów
markerów molekularnych ilustruje Ryc. 1,
a ich właściwości i wymagania zestawione są
w Tabeli 1.
DNA enzymami restrykcyjnymi, a następnie
poddaniu produktów trawienia rozdziałowi
na żelu agarozowym (Ryc. 2). Późniejsza mo-
dyfikacja metody wprowadziła dodatkowo
transfer rozdzielonych fragmentów DNA na
membranę, a następnie hybrydyzację DNA ze
specyficzną sondą znakowaną radioaktywnie
(S
OUTHERN
1975) lub fluorescencyjnie (N
EU
-
HAUS
-
URL
i N
EUHAUS
1993). Jako sondy sto-
suje się zwykle DNA lub cDNA o wielkości
300–500 pz, zaś wizualizację polimorfizmu
sygnałów hybrydyzacyjnych dokonuje się za
MARKERY OPARTE NA HYBRYDYZACJI DNA
RFLP — Polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych
Technika RFLP (ang. restriction fragment
length polymorphism) polega na trawieniu
Ryc. 1. Schematy przebiegu analizy poliformizmu dla wybranych systemów markerów molekularnych.
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
229
Tabela 1. Zestawienie właściwości najczęściej stosowanych systemów markerowych.
Cecha
RFLP
RAPD
AFLP
SSR
SSCP
CAPS
Ilość DNA (μg)
Jakość DNA
Poziom
polimorfizmu
Typ
dziedziczenia
Występowanie
w genomie
Wymagana
znajomość
sekwencji
Detekcja
radioaktywna
Trudności
techniczne
Wiarygodność
Powtarzalność
Koszty analiz
10
wysoka
średni
0,02
wysoka
średni
0,5-1,0
średnia
średni
0,05
średnia
wysoki
0,05
średnia
średni
0,05
średnia
średni
kodominacja
dominacja
dominacja
kodominacja
kodominacja
kodominacja
regiony
kodujące
nie
cały genom
nie
nie
cały genom
nie
tak
DNA
repetytywny
tak
cały
genom
tak
cały
genom
tak
tak/nie
nie
tak/nie
nie
tak/nie
nie
średnie
małe
wysokie
wysokie
średnie
średnie
wysoka
wysoka
wysokie
średnia
niska
niskie
średnia
wysoka
średnie
wysoka
wysoka
wysokie
wysoka
wysoka
wysokie
średnia
średnia
wysokie
pomocą autoradiografii. Zaletą tej metody
jest możliwość stwierdzenia homo- lub hete-
rozygotyczności analizowanego osobnika na
podstawie uzyskanego profilu genetycznego
oraz wysoka częstotliwość wykrywanego po-
limorfizmu. Źródłem zróżnicowania struktury
DNA określanego metodą RFLP mogą być de-
lecje, insercje, utrata miejsca restrykcyjnego
w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez
sondę, bądź też pojawienie się nowego miej-
sca restrykcyjnego w obrębie sekwencji roz-
poznawanej przez sondę lub poza sekwencją
komplementarną dla sondy. RFLP umożliwia
analizę specyficznych loci lub alleli, a uzy-
skane rezultaty cechuje wysoka wiarygod-
ność. Metoda ta wymaga jednak dużej ilości
DNA niezbędnego do trawienia restrykcyjne-
go oraz związana jest z wysokimi kosztami
otrzymania sondy.
VNTR — Zmienna liczba tandemowych
powtórzeń
Metoda VNTR (ang. variable number of
tandem repeats), po raz pierwszy została za-
stosowana do tworzenia mapy genetycznej
człowieka. Opiera się na analizie tandemowo
powtarzających się motywów sekwencyjnych
długości 11–60 pz zwanych minisatelitarnym
DNA. Liczba powtórzeń motywu minisate-
litarnego waha się od 2 do 1000 razy i jest
często zróżnicowana wśród genotypów tego
samego gatunku, co powodowane jest liczny-
mi zdarzeniami rekombinacyjnymi. Polimor-
Ryc. 2. Analiza RFLP obrazująca zmienność mi-
tochondrialnego DNA między liniami płodnymi
(ścieżka 1-2; 7-12) i męskosterylnymi (ścieżka
3-6) buraka cukrowego trawionych restryktazą
Eco
RI.
230
J
OANNA
S
ZTUBA
-S
OLIŃSKA
fizm minisatelitarnych loci wykrywany jest
poprzez trawienie DNA enzymami restrykcyj-
nymi, które rozpoznają sekwencje flankujące
minisatelitarne regiony. Dalsze etapy anali-
zy przebiegają jak w przypadku markerów
RFLP, z zastosowaniem sond homologicznych
do minisatelitarnego DNA. W wyniku analizy
uzyskuje się profile molekularne składające
się z wielu produktów o wielkości od 4–20
kpz, zwane „fingerprintami” (Ryc. 3)
i wydają się być identyczne dla różnych
osobników, nie świadczy o ich homologii
sekwencyjnej. Pojedyncze produkty składają-
ce się na wzór prążkowy, w rzeczywistości
mogą składać się z kilku fragmentów wspól-
nie migrujących w żelu. Aby uniknąć trudno-
ści związanych z interpretacją profili uzyska-
nych dzięki metodzie RAPD, stworzono al-
ternatywne systemy molekularne: DAF (ang.
DNA amplification fingerprinting) i AP-PCR
(ang. arbitrarily primed polymerase chain re-
action). W metodzie DAF losowa amplifikacja
DNA odbywa się z zastosowaniem startera
o długości 5–8 pz. Powstaje wówczas od 40
do 100 produków DNA, które rozdziela się
na żelu poliakrylamidowym. AP-PCR to mo-
dyfikacja metody RAPD, w której stosuje się
starter o długości 10–50 pz (W
ELSH
i M
C
C-
LELLAND
1990). Pierwsze dwa cykle reakcyjne
zachodzą w obniżonej temperaturze wiąza-
nia starterów, zaś kolejne w wyższej, warun-
kującej dużą specyficzność amplifikacji. Obie
modyfikacje metody RAPD umożliwiają sku-
teczniejszą analizę molekularną osobników
o bardzo niskim stopniu zróżnicowania ge-
netycznego.
ISSR — Polimorfizm sekwencji
międzymikrosatelitarnych
Technika ISSR (ang. inter simple sequen-
ce repeats) umożliwia identyfikację polimor-
fizmu długości obszarów DNA, zawartych po-
MARKERY BAZUJĄCE NA REAKCJI PCR
Z ZASTOSOWANIEM ARBITRALNEGO STARTERA
RAPD — Losowo amplifikowany
polimorficzny DNA
RAPD (ang. random amplified polymor-
phic DNA) to system markerowy bazujący na
reakcji PCR z zastosowaniem startera o przy-
padkowej sekwencji i długości 9–11 pz (W
IL
-
LIAMS
i współaut. 1990). Każdy taki starter
hybrydyzując do matrycy DNA, zapoczątko-
wuje amplifikację w wielu rejonach genomu
jednocześnie. Produkty amplifikacji rozdziela
się na żelu agarozowym, a ich detekcja odby-
wa się z użyciem bromku etydyny lub srebra
(Ryc. 4). Metoda ta jest szybsza, wydajniej-
sza i mniej pracochłonna niż RFLP. Potrzeba
również znacznie mniejszych ilości DNA, po-
nieważ jest on powielany w kolejnych run-
dach amplifikacji.
Stosując analizę RAPD należy być świado-
mym jej ograniczeń. Obecność produktów,
które migrują w żelu na ten sam dystans
Ryc. 3. Analiza VNTR obrazująca zmienność
locus minisatelitarnego w mitochondrialnym
DNA linii LO (ścieżka 1–2; 7–12) i MS (ścieżka
3-6) buraka cukrowego trawionych restryktazą
Bam
HI, poddanych hybrydyzacji z sondą kom-
plementarną do TR3 minisatelitarnego mtDNA.
Ryc. 4. Analiza RAPD obrazująca polimorfizm
organizacji genomowego DNA tetraploidalnych
zapylaczy buraka (ścieżka 1–12) z zastosowa-
niem startera OPK10.
Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli
231
między przeciwlegle skierowanymi, identycz-
nymi sekwencjami mikrosatelitarnymi. W re-
akcji PCR stosowane są startery o długości
16–18 pz odpowiadające motywom mikro-
satelitarnym, które posiadają kilka selektyw-
nych nukleotydów (Z
IETKIEWICZ
i współaut.
1994). Podczas reakcji powstaje od 10 do
60 produktów, które poddaje się rozdziałowi
na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym
oraz wizualizacji.
ISSR zyskuje dużą popularność, co wiąże
się zarówno z względną prostotą tej techni-
ki, wysoką powtarzalnością wyników, jak i z
przypuszczeniem, że markery mikrosatelitar-
ne mogą być sprzężone z obszarami kodują-
cymi.
liczby powtórzeń motywu nukleotydowego,
a także możliwość oceny homo- lub hetero-
zygotyczności analizowanego osobnika na
podstawie profilu genetycznego.
STS — Miejsca znaczone sekwencyjnie
Technika STS (ang. sequence tagged sites)
umożliwia analizę mikrosatelitarnych regio-
nów w genomie, które wykazują polimorfizm
ze względu na zmienną liczbę tandemowych
motywów nukleotydowych. Powtórzone jed-
nostki są otoczone sekwencjami unikatowy-
mi, mogącymi służyć jako startery do gene-
racji polimorficznych produktów. Sekwencje
te występują w genomie średnio co 10 kpz,
co sprawia iż mogą one służyć jako punkty
orientacyjne, względem których można loka-
lizować i badać określone sekwencje. System
markerowy STS stosowany jest głównie do
zagęszczania map genetycznych oraz do po-
szukiwania sprzężeń z cechami użytkowymi.
SCAR — Polimorfizm sekwencyjnie
charakteryzowanych regionów DNA
Użyteczność markerów RAPD może być
zwiększona, gdy kontynuacją ich analizy jest
system markerowy SCAR (ang. sequence
characterized amplified region). Technika
ta polega na sekwencjonowaniu końcowych
odcinków produktu RAPD, na bazie których
projektowane są startery długości 22–30 pz
stosowane do amplifikacji specyficznego lo-
cus. System markerowy SCAR identyfikuje
różnice sekwencyjne, które dziedziczą się
dominacyjnie, jednakże dodatkowe podda-
nie produktów PCR trawieniu restrykcyj-
nemu i rozdziałowi na denaturującym żelu
poliakrylamidowym może służyć określeniu
homo- lub heterozygotyczności analizowane-
go osobnika.
SNP — Polimorfizm pojedynczych
nukleotydów
System SNP (ang. single nucleotide po-
lymorphism) umożliwia wykrycie polimorfi-
zmu pojedynczego nukleotydu w obrębie ba-
danej sekwencji (B
ROOKES
1999). Polega na
amplifikacji określonego fragmentu genomu
w reakcji PCR i sekwencjonowaniu uzyskane-
go produktu. Następnie dokonuje się porów-
nania obrazów elektroforetycznych produk-
tów amplifikacji, co pozwala na stwierdze-
nie, czy mutacja w danym obszarze genomu
miała miejsce. Zaletą tej techniki jest wysoka
wydajność identyfikacji polimorfizmu w ob-
rębie badanej sekwencji, wadą jest wysoki
koszt analizy.
MARKERY BAZUJĄCE NA REAKCJI PCR
Z ZASTOSOWANIEM SPECYFICZNYCH STARTERÓW
SSR — Mikrosatelitarny polimorfizm
krótkich tandemowych powtórzeń
SSR (ang. simple sequence repeats) opie-
ra się na analizie sekwencji mikrosatelitar-
nych DNA, składających się z powtarzalnego
motywu długości 1–4 nukleotydów. Liczba
powtórzeń waha się w przedziale 10–50
i może być zmienna w obrębie osobników
tego samego gatunku. Dla genomu roślin-
nego najbardziej charakterystycznym po-
wtórzeniem jest dwunukleotyd (AT)
n
oraz
trójnukleotyd (TAT)
n
(M
ORGANTE
i współaut.
2002). Aby dokonać analizy sekwencji za
pomocą systemu SSR stosuje się biblioteki
genomowe, z których, przy użyciu sondy
mikrosatelitarnej, selekcjonuje się klony za-
wierające komplementarne loci. Wyselekcjo-
nowane klony poddaje się sekwencjonowa-
niu, by na ich bazie zaprojektować startery
dla amplifikacji repetytywnego DNA. Przy
projektowaniu starterów korzysta się rów-
nież z baz danych sekwencyjnych znaczni-
ków ekspresji EST (ang. expressed sequ-
ence tags) lub sekwencji spokrewnionych
gatunków. Dokonuje się także wzbogacania
istniejących bibliotek genomowych w se-
kwencje mikrosatelitarne dzięki selektywnej
hybrydyzacji fragmentów DNA przy użyciu
magnetycznych kulek pokrytych streptawi-
dyną bądź też nylonowych membran (R
AKO
-
CZY
-
TROJANOWSKA
i B
OLIBOK
2004).
W zależności od liczby powtórzeń ele-
mentu podstawowego na żelu poliakrylami-
dowym uzyskuje się produkty o różnej dłu-
gości. Zaletą systemu markerowego SSR jest
wysoka częstotliwość identyfikacji polimor-
ficznych sekwencji, wynikająca ze zmiennej
[ Pobierz całość w formacie PDF ]